制備型液相色譜（LC）簡(jiǎn)介

色譜是根據(jù)混合物中各組分的化學(xué)特性對(duì)其進(jìn)行分離的一種分離方法。制備型(Prep)色譜或純化色譜則是指利用色譜方法分離出一定量達(dá)到足夠純度的化合物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或處理的色譜方法。科學(xué)家首先要確定目標(biāo)化合物，然后開(kāi)發(fā)色譜方法，將目標(biāo)化合物從原料、副反應(yīng)或其它雜質(zhì)中成功分離出來(lái)。其總體目標(biāo)是滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的高通量和高效率需求，同時(shí)運(yùn)用各種純化技術(shù)達(dá)到相應(yīng)的規(guī)模、純度和重現(xiàn)性要求。

從大型制藥企業(yè)到小規(guī)模天然產(chǎn)物研究團(tuán)隊(duì)，純化色譜在眾多科研機(jī)構(gòu)中應(yīng)用非常廣泛。盡管應(yīng)用領(lǐng)域各不相同，用戶(hù)的一般要求卻非常相似，他們都希望分離出的終產(chǎn)物純度能達(dá)到95％或更高。

本初學(xué)者指南旨在為液相色譜工作者介紹快速發(fā)展的LC純化領(lǐng)域，內(nèi)容包括色譜分離方法開(kāi)發(fā)、方法放大所需的數(shù)學(xué)公式以及常用的餾分收集模式等基本原理。鑒于大多數(shù)制備型LC應(yīng)用都使用反相分離模式，本指南將主要介紹該分離模式。

采用液相色譜進(jìn)行純化

LC純化系統(tǒng)的配置與一般液相色譜系統(tǒng)相同，但增加了餾分收集器。樣品混合物被進(jìn)樣至色譜柱，色譜柱根據(jù)組分特有的化學(xué)或物理性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行分離。檢出組分時(shí)，系統(tǒng)會(huì)將其輸送至廢液，或者進(jìn)行收集用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。洗脫液收集操作既可由分析人員在組分洗脫時(shí)通過(guò)簡(jiǎn)單的手動(dòng)方式完成，也可以全自動(dòng)進(jìn)行，在自動(dòng)收集操作中，檢測(cè)器信號(hào)會(huì)觸發(fā)餾分收集器將液流輸送至收集容器中。輸送至收集容器的餾分純度取決于分離過(guò)程中化合物與其它鄰近洗脫雜質(zhì)的分離度。

圖1：制備型LC系統(tǒng)

判斷純化分離成功與否的標(biāo)準(zhǔn)包括通量、回收率和所得分離物的純度。純化分離由色譜峰的分離或“分離度”驅(qū)動(dòng)。以下是對(duì)分離度影響最為顯著的色譜參數(shù)：

• 色譜柱填料（固定相）
• 溶劑強(qiáng)度
• 溶劑類(lèi)型
• 緩沖液添加劑
• 柱溫

通過(guò)執(zhí)行方法開(kāi)發(fā)工作流程，可確定實(shí)現(xiàn)理想分離度的條件。該工作流程非常簡(jiǎn)單，但包含多個(gè)步驟，各步驟的復(fù)雜性和必要性根據(jù)樣品的獨(dú)特性質(zhì)而異。無(wú)論樣品分離用于何種應(yīng)用、采用哪種模式（例如反相色譜、離子交換色譜等），方法開(kāi)發(fā)工作流程通常都是相同的。

圖2：通用制備型工作流程

在設(shè)計(jì)工作流程之前，十分重要的考慮因素是目標(biāo)化合物的性質(zhì)。如果從熟知的來(lái)源或新來(lái)源中分離已知化合物，很容易通過(guò)檢索相關(guān)文獻(xiàn)獲取有關(guān)目標(biāo)化合物色譜行為的信息，并從已發(fā)表的方法中選擇適用的分離方法。而對(duì)于含有未知類(lèi)型化合物的粗提取物，設(shè)計(jì)分離方案的難度較大。在這種情況下，可在初始分離之后進(jìn)行一系列探索性實(shí)驗(yàn)，獲取更多有關(guān)目標(biāo)化合物的信息，例如pKa、分子量、溶解性、穩(wěn)定性、UV光譜和生物活性等。然后根據(jù)這些信息修改初始分離方法，使其符合化合物的化學(xué)和物理性質(zhì)要求。這些信息不僅有助于方法開(kāi)發(fā)，還可以在收集到餾分之后，為掌握目標(biāo)產(chǎn)物的穩(wěn)定性提供非常大的幫助。

第一步要制備樣品并使用快速探索梯度執(zhí)行常規(guī)分離。這一步通常為小規(guī)模分離，目的是節(jié)省寶貴的樣品。根據(jù)該分離的結(jié)果，可以計(jì)算洗脫目標(biāo)化合物的溶劑條件并進(jìn)一步優(yōu)化分離條件，盡可能提高分離度。此外，可能還需要對(duì)上樣量進(jìn)行研究，確定可維持適當(dāng)分離度以實(shí)現(xiàn)高純度分離的理想上樣量。

確定分離方法和理想上樣量后，通常要針對(duì)具有應(yīng)用前景或潛在價(jià)值的分離物進(jìn)行方法放大（但并不是必須執(zhí)行）。在本初學(xué)者指南中，術(shù)語(yǔ)“規(guī)模”(scale)旨在描述滿(mǎn)足產(chǎn)物純度、通量和收率等應(yīng)用目標(biāo)所需的儀器和方法。若要“放大”(scaled-up)方法，則需要將方法轉(zhuǎn)換至硬件配置可處理更高上樣量的系統(tǒng)。從本質(zhì)上來(lái)講，方法放大就是借助一系列方法放大計(jì)算和硬件更改，在分離度保持不變的前提下，將方法從分析級(jí)內(nèi)徑色譜柱轉(zhuǎn)換到制備級(jí)內(nèi)徑色譜柱的過(guò)程。

圖3：用于分析級(jí)和制備級(jí)純化的色譜柱內(nèi)徑對(duì)比

樣品

可用于分離特定化合物的樣品來(lái)源十分廣泛，包括藥物中間體、天然產(chǎn)物、保健食品、飲料和工業(yè)產(chǎn)品等。只要原料可以進(jìn)行提取并溶解于液體基質(zhì)中，就可以使用色譜純化其中的各組分。

樣品提取技術(shù)的選擇取決于待提取原料的復(fù)雜性。對(duì)于天然產(chǎn)物，通常將樣品干燥并研磨成細(xì)顆粒用以提高提取效率。接下來(lái)采用滲濾（用于大體積樣品）或浸提（用于小體積樣品）等技術(shù)提取目標(biāo)化合物。這兩種技術(shù)都需要向樣品原料中加入溶劑，然后在超聲、渦旋或浸泡后收集溶質(zhì)。收集提取物之后，和所有HPLC樣品一樣，樣品在進(jìn)樣前必須過(guò)濾，以除去顆粒并排除氣泡。

分離模式

制備型色譜主要有四種分離模式：反相、正相、凝膠滲透和離子交換。合適的分離模式取決于待分析樣品、提取物或混合物與固定相和溶劑之間的相容性。

反相色譜是開(kāi)發(fā)純化方法時(shí)最常用的技術(shù)，其使用極性弱于洗脫溶劑極性的固定相。反相色譜使用水與乙腈或甲醇的混合物作為洗脫液，其中還會(huì)添加緩沖液（酸或堿）用于控制樣品的離子化程度以及結(jié)合固定相中未反應(yīng)的游離硅醇基團(tuán)。硅膠型固定相中的鍵合相材料或吸附劑采用甲硅烷基化試劑進(jìn)行了衍生化處理，可減少峰拖尾并提高色譜重現(xiàn)性。上述衍生化試劑處理（硅烷化）以及不同的碳載量將賦予不同制造商的色譜柱獨(dú)特的分離特征1。

快速啟動(dòng)方法開(kāi)發(fā)

建立反相分離方法時(shí)，通常選擇小規(guī)格的分析型色譜柱（內(nèi)徑≤ 4.6 mm），并且其柱長(zhǎng)和填料應(yīng)可擴(kuò)展至較大規(guī)格（內(nèi)徑≥ 10 mm）內(nèi)徑的色譜柱，以便將來(lái)放大方法。方法開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵是找到可實(shí)現(xiàn)出色分離的適用溶劑體系。對(duì)于酸性化合物，通常采用pH為酸性的水性流動(dòng)相，并以甲醇或乙腈作為強(qiáng)溶劑。濃度為0.1%的甲酸是常用的緩沖液添加劑，因?yàn)槠浼嫒軺V和質(zhì)譜檢測(cè)。如需鑒定未知化合物或獲取純分離物用于進(jìn)一步研究，MS兼容性將非常有用。如需讓堿性分子保持未電離狀態(tài)，可使用pH為堿性而非酸性的流動(dòng)相。使用任何pH的緩沖液之前，都應(yīng)參閱色譜柱固定相說(shuō)明書(shū)了解其兼容性。水性流動(dòng)相通常由位置A處的泵泵送，強(qiáng)溶劑由位置B處的泵泵送。本初學(xué)者指南將分別使用“A”和“B”指代泵表中的水性溶劑和強(qiáng)溶劑。

探索

盡管復(fù)雜的分離受色譜柱填料選擇性的影響最大，但在開(kāi)發(fā)純化分離方法時(shí)，通過(guò)快速探索梯度得到初始樣品分離方法并優(yōu)化是十分有效的方法開(kāi)發(fā)途徑。探索梯度的作用是大致確定從色譜柱上洗脫目標(biāo)化合物所需的溶劑濃度。探索梯度一般從一致的強(qiáng)溶劑濃度(2%-10%)開(kāi)始，線(xiàn)性增加至25%、50%、75%和90%-95%。

表1：快速線(xiàn)性梯度探索研究示例

圖4：快速探索梯度。隨著梯度斜率減小，分離度增大2

運(yùn)行探索梯度之后，在進(jìn)行下一步之前應(yīng)審查并評(píng)估所得結(jié)果，弄清以下問(wèn)題：

• 快速探索梯度的分離度是否足以分離目標(biāo)化合物？
• 快速探索梯度的速度或效率是否滿(mǎn)足要求？
• 采用所需上樣量時(shí)，目標(biāo)化合物與其它峰能否保持分離？

如果探索梯度結(jié)果未達(dá)到要求，可通過(guò)方法聚焦進(jìn)行優(yōu)化，也可通過(guò)更改pH值、溶劑或其它色譜變量對(duì)分離方法進(jìn)行整體調(diào)整。

優(yōu)化方法

通過(guò)改變強(qiáng)溶劑和弱溶劑組成可優(yōu)化目標(biāo)化合物分離度理想的探索梯度。溶劑組成可以保持恒定（等度），也可以根據(jù)給定的單位時(shí)間或色譜柱體積進(jìn)行變化（梯度）。

等度洗脫

在等度分離中，弱溶劑和強(qiáng)溶劑比率在單位時(shí)間內(nèi)保持不變。等度溶劑可由分析人員離線(xiàn)制備，或使用能以恒定的預(yù)定流速配比不同溶劑的HPLC泵通過(guò)在線(xiàn)混合制得。這種洗脫模式便捷、一致且穩(wěn)定，因?yàn)樵谙到y(tǒng)間轉(zhuǎn)移方法時(shí)，延遲體積對(duì)保留時(shí)間的影響可以忽略不計(jì)。

等度洗脫有一定缺陷，并不是所有分離都適用。它的一些固有問(wèn)題包括：早期洗脫峰分離度低、因峰拖尾導(dǎo)致峰對(duì)稱(chēng)性不佳、由于譜帶增寬導(dǎo)致靈敏度降低，以及由于強(qiáng)保留化合物積累導(dǎo)致色譜柱污染問(wèn)題等。

梯度洗脫

反相色譜或離子交換色譜中的梯度分離通常在線(xiàn)混合流動(dòng)相，以便在整個(gè)分析過(guò)程中使有機(jī)溶劑比例穩(wěn)定升高。梯度開(kāi)始時(shí)，溶劑強(qiáng)度較低，分析物會(huì)被分配到固定相中或保留在色譜柱柱頭。隨著溶劑強(qiáng)度增加，分析物被轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相，沿色譜柱移動(dòng)，最終被
洗脫。

梯度洗脫可在合理的時(shí)間范圍內(nèi)分離疏水性不同的多種分析物。另外，梯度洗脫還可提高峰分離度，由于峰高增加，靈敏度也有所提升。強(qiáng)保留組分會(huì)在運(yùn)行結(jié)束時(shí)從色譜柱中洗脫出來(lái)，因此還可盡可能減少色譜柱污染。

當(dāng)然，梯度洗脫也存在一些弊端。該方法要求實(shí)現(xiàn)一致、無(wú)脈沖的在線(xiàn)梯度混合，因此通常需要昂貴的泵設(shè)備。此外，采用某些溶劑的組合混合流動(dòng)相時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。由于梯度結(jié)束后需要重新平衡，運(yùn)行時(shí)間會(huì)很長(zhǎng)，而且因?yàn)閮x器駐留時(shí)間(Vd)不同，若
不適當(dāng)使用補(bǔ)償溶劑，會(huì)帶來(lái)方法轉(zhuǎn)換問(wèn)題。

線(xiàn)性梯度

在整個(gè)運(yùn)行過(guò)程中，線(xiàn)性梯度的強(qiáng)溶劑比例以恒定速率增加。該方法常在快速篩選實(shí)驗(yàn)中被用于快速確定洗脫目標(biāo)峰的溶劑比例，同時(shí)保持較短的運(yùn)行時(shí)間，從而縮短洗脫時(shí)間并降低溶劑成本。

圖5：線(xiàn)性梯度的溶劑曲線(xiàn)

分段梯度

分段梯度是多個(gè)線(xiàn)性梯度的組合，每個(gè)區(qū)段具有不同的斜率或陡度。平緩的區(qū)段用于分離目標(biāo)化合物，而陡峭的區(qū)段是對(duì)色譜圖分離度要求不高的區(qū)域（例如分離后的清洗過(guò)程）。

圖6：分段梯度的溶劑曲線(xiàn)

梯度聚焦

梯度聚焦通常比分段梯度的運(yùn)行時(shí)間更短且變化更大。一般情況下，剛進(jìn)樣時(shí)流動(dòng)相的溶劑強(qiáng)度非常低，接下來(lái)溶劑強(qiáng)度會(huì)迅速升至洗脫目標(biāo)化合物所需的溶劑比例以下2%-5％（例如，洗脫濃度22% - 2％ = 20％開(kāi)始平緩梯度）。然后運(yùn)行平緩梯度，梯度斜率約為快速探索分離所確定的斜率的1/5，最后終止于目標(biāo)化合物的洗脫濃度以上2%-5％（例如，22% + 2% = 24%終止平緩梯度）。最后，溶劑百分比快速增加，用以清洗殘留在色譜柱中的所有樣品組分。

 圖7：梯度聚焦的溶劑曲線(xiàn)

開(kāi)發(fā)梯度聚焦

采用快速探索梯度分析樣品之后，可利用以下公式為目標(biāo)化合物開(kāi)發(fā)梯度聚焦。每個(gè)公式之后都附有理論示例。

首先必須確定探索梯度運(yùn)行所用儀器的系統(tǒng)延遲體積。關(guān)于延遲體積測(cè)定的說(shuō)明可參閱本初學(xué)者指南的“延遲體積測(cè)定”部分，或訪(fǎng)問(wèn)www.waters.com/prepcalculator ，使用“分析級(jí)至制備級(jí)梯度轉(zhuǎn)換器”應(yīng)用工具獲取。

此外，還需確定探索梯度運(yùn)行所用色譜柱的柱體積。使用圓柱體體積V = πr2h和除去填料所占體積之后的可用柱體積比例可計(jì)算出該值，例如V = πr2h (66%)。“分析級(jí)至制備級(jí)梯度轉(zhuǎn)換器”應(yīng)用程序工具也可用于執(zhí)行此計(jì)算。

公式1：色譜柱體積

公式2：梯度形成和檢測(cè)器之間的補(bǔ)償體積

公式3：到達(dá)檢測(cè)器所需的時(shí)間到達(dá)檢測(cè)器所

公式4：達(dá)到洗脫濃度的時(shí)間

公式5：洗脫濃度(%)

公式6：色譜柱體積(CV)數(shù) 

公式7：探索梯度斜率

公式8：梯度聚焦斜率

梯度聚焦區(qū)段為：估算洗脫比例以下5%至該比例以上3%~5%。例如，洗脫比例為79％。

公式9：梯度聚焦區(qū)段的時(shí)長(zhǎng)

最后一步是使用上述公式計(jì)算出的值創(chuàng)建梯度聚焦。

探索梯度:

時(shí)間 (mins)	流速 (mL/min)	溶劑
		%A	%B
0.00	1.5	95	5
7.00	1.5	5	95
8.00	1.5	5	95
9.00	1.5	95	5

 

梯度聚焦:

時(shí)間 (mins)	流速 (mL/min)	溶劑
		%A	%B
0.00	1.5	95	5
1.00	1.5	26	74
4.32	1.5	16	84
6.00	1.5	5	95
7.00	1.5	95	5

圖8：采用快速梯度和梯度聚焦分離萘普生、苯氧苯丙酸、雙氯芬酸和異丁苯丙酸所得的結(jié)果對(duì)比。可以看到用星號(hào)標(biāo)記的目標(biāo)峰在梯度聚焦分離中分離度更高且保留時(shí)間更短

替代方法開(kāi)發(fā)

如果等度分離或梯度聚焦都不能完全分離目標(biāo)化合物，可以通過(guò)更改溶劑、pH值、固定相和/或溫度重新開(kāi)發(fā)分離方法。這類(lèi)修改會(huì)對(duì)分離產(chǎn)生顯著影響，因此進(jìn)行以上任何更改之后都必須運(yùn)行探索梯度并進(jìn)行方法優(yōu)化。

溶劑

HPLC流動(dòng)相由三種組分組成：弱溶劑、強(qiáng)溶劑和改性劑。溶劑必須具有高純度、可與檢測(cè)器兼容、不與樣品反應(yīng)，并且粘度應(yīng)較低，以保持低系統(tǒng)背壓。

反相色譜通常以水作為弱溶劑，常用的強(qiáng)溶劑是乙腈和/或甲醇，因?yàn)樗鼈冋扯鹊汀⑷軇?qiáng)度高，并且在短波長(zhǎng)范圍內(nèi)兼容UV檢測(cè)。此外，乙腈和甲醇還能提供理想峰形，分離之后易于通過(guò)蒸發(fā)去除，而且不與大多數(shù)樣品反應(yīng)。

和所有用于色譜分離的溶劑一樣，分析樣品時(shí)必須保持檢測(cè)波長(zhǎng)高于已知的溶劑UV截止波長(zhǎng)值。若波長(zhǎng)低于該值，檢測(cè)器會(huì)將溶劑組分變化記錄為基線(xiàn)漂移或其它色譜干擾。

表2：常用色譜溶劑及其UV截止波長(zhǎng)

峰分離和出峰順序會(huì)根據(jù)分離所用的強(qiáng)溶劑不同而改變。預(yù)測(cè)可使目標(biāo)化合物達(dá)到最高分離度的溶液非常困難，因此，通常需要通過(guò)試錯(cuò)法來(lái)確定強(qiáng)溶劑。或者，也可以使用混合強(qiáng)溶劑（例如，50:50乙腈/甲醇）達(dá)到理想的洗脫順序或分離度。

圖9：乙腈和甲醇的洗脫順序?qū)Ρ?

pH值

流動(dòng)相pH值是控制反相分離保留性的一個(gè)非常重要的變量。化合物通常都含有一個(gè)或多個(gè)酸性或堿性官能團(tuán)，因此大多數(shù)反相流動(dòng)相的pH值都有必要加以控制。

當(dāng)酸的pH高于或低于其pKa 2個(gè)以上pH單位時(shí)，99％以上的酸將分別處于電離或未電離狀態(tài)。相反，堿在pH值低于其pKa時(shí)電離，在pH值高于pKa時(shí)為未電離狀態(tài)。未電離物質(zhì)的極性較小（更疏水），因而在反相體系中保留性更強(qiáng)。因此，酸在低pH值條件下保留性更好，而堿在高pH值條件下保留性更好?。

圖10：流動(dòng)相pH值對(duì)分析物保留性的影響。選擇對(duì)應(yīng)于保留圖穩(wěn)定區(qū)域的流動(dòng)相pH值可實(shí)現(xiàn)十分穩(wěn)定的分離。非電離形式的酸和堿保留性非常理想，而中性分析物的保留性不受pH值影響

如果流動(dòng)相pH值接近目標(biāo)化合物的pKa，則很小的pH值變化也會(huì)顯著影響其保留性，從而直接影響分離穩(wěn)定性。我們通過(guò)添加緩沖液來(lái)控制流動(dòng)相pH值。加入少量酸或堿時(shí)，緩沖液可保持pH值不變。緩沖液在其pKa ±1個(gè)pH值單位范圍內(nèi)使用十分有效，不過(guò)有的緩沖液在其pKa ±2個(gè)pH值單位范圍內(nèi)也具有足夠的緩沖能力。

圖11：化合物選擇性與pH值。酸性和堿性化合物的洗脫順序因其電離情況不同而發(fā)生了顯著變化，而中性化合物未受影響

在選擇運(yùn)行pH值時(shí)，還應(yīng)考慮色譜柱穩(wěn)定性。硅膠基色譜柱在pH 2至pH 8之間性能非常理想。鍵合相在低pH值下易水解，而在高pH值下，硅膠主鏈會(huì)變得易溶解。當(dāng)pH值高于8時(shí)，需要使用非硅膠基質(zhì)顆粒或具有專(zhuān)用鍵合相（在高pH值條件下穩(wěn)定）的顆粒。pH值限值和通用處理建議可參閱色譜柱說(shuō)明書(shū)或訪(fǎng)問(wèn)色譜柱制造商網(wǎng)站。

圖12：基于沃特世表面帶電雜化(CSH)硅膠基質(zhì)的專(zhuān)用鍵合相示例及其建議pH值范圍

當(dāng)色譜方法用于純化目的時(shí)，用于調(diào)節(jié)pH的緩沖液添加劑必須具有足夠的揮發(fā)性，以便從純化后的分離物中去除。此外，使用揮發(fā)性添加劑時(shí)，必須注意避免MS源被污染或產(chǎn)生沉淀。甲酸、乙酸和醋酸銨等常用添加劑以0.05%~0.1％的濃度溶解于流動(dòng)相時(shí)性能非常理想。不建議在純化或MS應(yīng)用中使用液相色譜分離最常用的緩沖液添加劑 - 磷酸鹽。

建議的緩沖液濃度為5~10 mM。如需使用緩沖液，應(yīng)在制備完成后進(jìn)行過(guò)濾，不使用時(shí)應(yīng)沖洗泵管路，以避免在線(xiàn)沉淀，還需定期更換溶液以防止微生物生長(zhǎng)積聚。

圖13：流動(dòng)相緩沖液選擇指南，附MS兼容性

固定相

色譜柱固定相會(huì)顯著影響分離。反相色譜使用C18到C8的固定相，某些固定相還含有專(zhuān)為提高選擇性和分離能力而設(shè)計(jì)的鍵合相。許多實(shí)驗(yàn)室的色譜柱庫(kù)存有限，因此更換固定相通常是調(diào)整溶劑和pH值均無(wú)法達(dá)到足夠分離度時(shí)的最后選擇。沃特世常見(jiàn)色譜柱選擇卡(www.waters.com)可對(duì)比不同制造商色譜柱固定相的選擇性。在方法開(kāi)發(fā)的早期階段，該工具非常適合用于比較色譜柱選擇性。

圖14：沃特世常見(jiàn)色譜柱選擇卡，可通過(guò)www.waters.com/selectivitychart 上的Web Toolbox（網(wǎng)絡(luò)工具箱）訪(fǎng)問(wèn)

柱長(zhǎng)

色譜柱柱長(zhǎng)也是影響分離性能的因素之一。市面上有多種色譜柱柱長(zhǎng)可供選擇，包括25 mm、50 mm、100 mm、150 mm和250 mm。較短的色譜柱塔板數(shù)較少，適用于快速分離，而較長(zhǎng)的色譜柱塔板數(shù)較多，因此保留時(shí)間較長(zhǎng)。隨著柱長(zhǎng)增加，柱壓、運(yùn)行時(shí)間、溶劑消耗量和成本也會(huì)相應(yīng)地增加，因此能夠達(dá)到足夠分離度的盡可能短的色譜柱是十分理想的選擇。

圖15：不同柱長(zhǎng)色譜柱的分離度對(duì)比。100 mm色譜柱改善了主峰與鄰近雜質(zhì)之間的分離度，總運(yùn)行時(shí)間隨柱長(zhǎng)增加而延長(zhǎng)3

粒徑

樣品流經(jīng)填料時(shí)，色譜柱阻止樣品譜帶擴(kuò)散或展寬的能力稱(chēng)為“柱效”。由于小顆粒內(nèi)的峰擴(kuò)散較低，小粒徑色譜柱的柱效更高。高柱效可使峰寬更窄，賦予色譜柱更強(qiáng)的分離能力。

制備型色譜柱的粒徑通常為5~10 μm，超高壓分析型分離則使用粒徑為1.7~3.5 μm的色譜柱。雖然極小的粒徑可帶來(lái)更高的柱效，但代價(jià)是色譜柱成本和系統(tǒng)背壓增加。出于以上原因，以較高流速分離粗制樣品混合物的大規(guī)模制備型色譜柱一般不會(huì)采用粒徑非常小的顆粒。

圖16：采用不同粒徑色譜柱分離相同物質(zhì)的色譜結(jié)果對(duì)比3

溫度

由于不同的溫度會(huì)影響色譜選擇性，因此加熱色譜柱是優(yōu)化具體樣品分離結(jié)果的一種非常方便的手段。流動(dòng)相粘度和系統(tǒng)整體壓力隨溫度升高而降低，進(jìn)而降低系統(tǒng)、接頭和色譜柱壓力，最終有利于提高運(yùn)行的穩(wěn)定性。調(diào)節(jié)溫度還可縮短保留時(shí)間并改變分離的選擇性。峰分離度會(huì)隨溫度變化增大還是減小很難預(yù)測(cè)，因而溫度對(duì)于每次具體分離有特定的影響。

盡管溫度控制是小規(guī)模色譜的常規(guī)控制手段，但制備級(jí)純化很少將溫度作為操控色譜分離的參數(shù)。首先，大內(nèi)徑色譜柱難以從外部均勻加熱。其次，大規(guī)模的高流速分離中通常會(huì)保持流入溶劑的溫度。雖然電熱毯和柱溫箱可滿(mǎn)足小規(guī)模分離的加熱需求，卻無(wú)法在直徑方向上均勻加熱大型色譜柱。因此，色譜柱直徑方向上會(huì)形成溫度梯度，對(duì)色譜分離產(chǎn)生不利影響。

若必須借助溫度控制來(lái)保持樣品溶解性，可在制備型色譜柱柱頭處連接一段管路，并將其放置在加熱的水浴中，以消除溫度梯度。這一段管路被用作預(yù)加熱器，將流入溶劑平衡至所需溫度?。將來(lái)需要放大的色譜方法最好在室溫條件下開(kāi)發(fā)，盡量不使用溫度控制手段。

圖17：制備級(jí)色譜柱加熱。制備型色譜柱柱頭連接的5 mL定量環(huán)浸沒(méi)在水浴中，用作溶劑預(yù)加熱器?

方法放大

若初步證明某分離物具有潛在價(jià)值，可“放大”分離方法，分離出更大量的該分離物以供進(jìn)一步評(píng)估。要在大規(guī)模分離中維持小規(guī)模分離的各項(xiàng)屬性（如分離度等）很容易。必須借助已定義的數(shù)學(xué)公式修改流速、上樣量和系統(tǒng)硬件參數(shù)，從而有效地將分離方法
轉(zhuǎn)移至更高容量的色譜柱。

方法放大的第一階段通常是獲取mg級(jí)到g級(jí)的分離物用于從早期生物學(xué)評(píng)價(jià)到建立具有改進(jìn)治療特性的產(chǎn)品類(lèi)似物的結(jié)構(gòu) - 活性關(guān)系等多種用途。方法放大的下一階段需要獲取100 g到數(shù)千克（或更多）的目標(biāo)物質(zhì)用于臨床前和臨床開(kāi)發(fā)，如果開(kāi)發(fā)成功，將最終決定全面投產(chǎn)。這種規(guī)模的分離要用到良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)等指導(dǎo)文件和質(zhì)量控制手段1。

表3：色譜規(guī)模、目標(biāo)物質(zhì)量和相關(guān)應(yīng)用。

方法放大工作流程分為幾個(gè)步驟。必須保證放大計(jì)算的準(zhǔn)確性，否則最終可能無(wú)法達(dá)到小規(guī)模分離的分離度。為了提高方法放大的成功率，同時(shí)維持保留時(shí)間和選擇性不變，需要仔細(xì)考慮以下要求：

• 小規(guī)模和大規(guī)模分離必須使用相同的流動(dòng)相。
• 使用填料、柱長(zhǎng)和粒徑相同的色譜柱非常容易進(jìn)行方法放大（或者在保持初始方法的柱長(zhǎng)-粒徑比率(L/dp)不變的前提下改變粒徑）。
• 應(yīng)使用相同的稀釋溶劑制備濃度相同的樣品。

圖18：方法放大工作流程。

確定延遲體積

在放大方法或更改系統(tǒng)時(shí)，延遲體積（即系統(tǒng)體積或死體積）對(duì)于維持早洗脫峰的峰分離度很重要。延遲體積是指梯度形成處到色譜柱柱頭之間的體積。在高壓混合LC系統(tǒng)中，該體積主要包括混合器、連接管路和自動(dòng)進(jìn)樣器定量環(huán)的體積。低壓混合系統(tǒng)包括來(lái)自泵的上游溶劑，因此這些額外的管路體積加上泵頭（一個(gè)或多個(gè)）體積，再加上混合器、連接管路和自動(dòng)進(jìn)樣器定量環(huán)的體積共同組成了總延遲體積。

圖19：導(dǎo)致延遲體積的純化流路組件（用虛線(xiàn)圈出）。

等度分離的流動(dòng)相組分通過(guò)在線(xiàn)方式混合，這種情況下仍然存在延遲體積，但由于流動(dòng)相濃度恒定，色譜分離結(jié)果中觀察不到差異。另一方面，梯度方法則依賴(lài)流動(dòng)相濃度隨時(shí)間的變化實(shí)現(xiàn)峰分離。在梯度方法中補(bǔ)償延遲體積可確保峰保留時(shí)間得以維持，需要收集純餾分時(shí)，這一點(diǎn)尤為重要。

如需測(cè)定延遲體積，可根據(jù)www.waters.com/prepcalculator 上的“分析級(jí)至制備級(jí)梯度轉(zhuǎn)換器”所用的方法，采用流動(dòng)相A和含有UV吸收能力不同的添加劑（例如0.05 mg/mL尿嘧啶或0.2％丙酮的乙腈溶液）的流動(dòng)相B溶劑組成分級(jí)梯度進(jìn)行測(cè)定。

表4：確定延遲體積的步驟。

圖20：用于測(cè)定分析型系統(tǒng)和制備型系統(tǒng)的系統(tǒng)體積的分級(jí)梯度。

色譜柱容量
在純化色譜分離中，保持目標(biāo)化合物具有足夠的分離度是一個(gè)關(guān)注重點(diǎn)。色譜柱容量（或稱(chēng)上樣量）以化合物與鄰近峰的分離度為衡量標(biāo)準(zhǔn)。雖然色譜柱容量主要受色譜柱柱長(zhǎng)和內(nèi)徑影響，樣品溶解性和樣品混合物的復(fù)雜性等其它因素對(duì)此也有一定影響。色譜柱容量的趨勢(shì)如下：

• 色譜柱容量主要取決于具體樣品的溶解性。
• 簡(jiǎn)單混合物的色譜柱容量更高。
• 如果需要較高的分離度，應(yīng)降低色譜柱容量。
• 色譜柱容量在很大程度上取決于上樣條件。

表5：常用制備型色譜柱規(guī)格的估計(jì)上樣量(mg)。
示例：以4.6 x 50 mm的色譜柱為例，其預(yù)計(jì)上樣量為每20 μL進(jìn)樣對(duì)應(yīng)3 mg。

在方法放大之前，應(yīng)通過(guò)上樣量研究來(lái)確定特定目標(biāo)化合物的理想上樣量。這些研究以小規(guī)模進(jìn)行，并采用以下其中一種方法：制備高濃度樣品，然后逐步增大進(jìn)樣體積；或者制備多個(gè)濃度的樣品，進(jìn)樣體積保持恒定。這兩種方法的目標(biāo)都是在保持目標(biāo)化合物與鄰近雜質(zhì)之間具有足夠分離度的前提下，確定可進(jìn)樣的最大樣品濃度或進(jìn)樣體積。確定色譜柱容量后，可利用公式將其放大，以便用于內(nèi)徑更大的色譜柱和大規(guī)模工作流程。

圖21：上樣量研究。可以看到星號(hào)標(biāo)注的峰的分離度隨上樣量增大而降低。

公式10：上樣濃度放大

因此，要將4.6 mm x 50 mm分析型色譜上1800 μg (1.8 mg)的上樣量等效放大至19 mm x 50 mm制備型色譜柱：

公式11：進(jìn)樣體積放大

 

要放大20 μL的進(jìn)樣體積：

柱頭稀釋

DMSO等強(qiáng)溶劑可以改善樣品溶解性，進(jìn)而可能增大色譜柱容量。然而，進(jìn)樣大體積的強(qiáng)溶劑會(huì)導(dǎo)致色譜峰畸變，這反而會(huì)減少可成功分離的產(chǎn)物量。若強(qiáng)溶劑從進(jìn)樣器輸送到柱頭的過(guò)程中在水性溶劑流中間形成溶劑簇，就會(huì)導(dǎo)致峰畸變。溶劑簇邊緣的強(qiáng)樣品溶劑被水性溶劑稀釋?zhuān)赡軙?huì)引起樣品沉淀，這種沉淀可能會(huì)堵塞流路塞，進(jìn)而導(dǎo)致高壓系統(tǒng)關(guān)閉。

圖22：流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)稀釋樣品簇。如果使用強(qiáng)稀釋劑制備樣品，則樣品簇在流經(jīng)含有水性流動(dòng)相的色譜柱時(shí)，樣品簇邊緣可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。

如果沉淀沒(méi)有導(dǎo)致系統(tǒng)關(guān)閉，樣品將進(jìn)入色譜柱，但色譜柱上不會(huì)有樣品被保留，直到樣品簇被流動(dòng)相稀釋。進(jìn)樣體積較大時(shí)，樣品簇必須沿著色譜柱移動(dòng)相當(dāng)長(zhǎng)的一段距離才能達(dá)到所需的稀釋度。在這種情況下，樣品沉積為寬譜帶，占據(jù)大部分色譜柱體積，這會(huì)導(dǎo)致需要大量洗脫液才能洗脫出很寬的峰，且峰分離度不足。通過(guò)嚴(yán)格限制進(jìn)樣體積和上樣量可以避免這種情況。替代方法是用水或弱溶劑對(duì)樣品進(jìn)行充分稀釋?zhuān)源_保足夠的保留性能。

圖23：將樣品溶于強(qiáng)溶劑中進(jìn)樣的傳統(tǒng)進(jìn)樣方法。樣品簇在沿著色譜柱移動(dòng)的過(guò)程中被稀釋?zhuān)瑫?huì)導(dǎo)致峰畸變。

由于通量和回收率受到影響，上述兩種方法都不理想。柱頭稀釋系統(tǒng)采用另一種配置，能夠在色譜柱入口處使用水性稀釋劑流對(duì)輸送至此的樣品簇進(jìn)行連續(xù)稀釋。輸送至色譜柱的流速非常快，因此不會(huì)產(chǎn)生沉淀。接下來(lái)，樣品分子會(huì)被吸附到填料上，形成非常窄的譜帶，進(jìn)而被洗脫為分離良好的小體積峰。柱頭稀釋還使得樣品不容易在定量環(huán)或柱頭處發(fā)生沉淀，因此能改善系統(tǒng)穩(wěn)定性。由于樣品組分峰之間的分離度得以改善，我們可以增大進(jìn)樣量，從而減少分離所需的進(jìn)樣次數(shù)。在實(shí)際操作中，采用柱頭稀釋通常可將色譜柱上樣量提升3~5倍。發(fā)生高壓關(guān)閉的頻率降低，色譜柱壽命也更長(zhǎng)。

圖24：柱頭稀釋系統(tǒng)。樣品簇被輸送到色譜柱入口，并在此經(jīng)水性稀釋劑流連續(xù)稀釋?zhuān)蚨粫?huì)產(chǎn)生沉淀。樣品譜帶可洗脫為具有理想分離度的小體積峰?。

圖25：采用傳統(tǒng)進(jìn)樣方法和柱頭稀釋法進(jìn)樣溶于強(qiáng)溶劑的樣品結(jié)果對(duì)比。柱上進(jìn)樣量為1000 μL（相當(dāng)于133 mg）3。

流速放大

為了在放大過(guò)程中保障分離質(zhì)量，小規(guī)模和大規(guī)模色譜柱的線(xiàn)性流速必須保持恒定，因此在柱長(zhǎng)、粒徑和填料相同的大規(guī)模和小規(guī)模色譜柱之間進(jìn)行流速放大效果十分理想。放大流速時(shí)必須考慮系統(tǒng)的硬件能力，例如最大泵流量和背壓限制。如果硬件無(wú)法滿(mǎn)足流速要求，應(yīng)考慮更換合適的儀器以滿(mǎn)足放大要求。

公式12：流速放大

例如，假設(shè)分析型色譜柱(5 μm, 4.6 mm x 50 mm)的流速為1.5 mL/min，則制備型色譜柱(5 μm, 19 mm x 50 mm)的流速通過(guò)以下公式計(jì)算：

梯度持續(xù)時(shí)間放大

一般來(lái)說(shuō)，如果可通過(guò)調(diào)節(jié)流速保持流動(dòng)相線(xiàn)性速度不變，進(jìn)行方法放大時(shí)不需要更改梯度。如果柱長(zhǎng)不同，則必須計(jì)算梯度時(shí)間，以保持小規(guī)模分離時(shí)的分離度和保留時(shí)間。

公式13：梯度時(shí)間放大

例如，50 mm分析型色譜柱上持續(xù)5 min的線(xiàn)性梯度區(qū)段在100 mm制備型色譜柱上應(yīng)為10 min：

制備轉(zhuǎn)換器

上樣量、流速和梯度的放大計(jì)算也可以通過(guò)制備型OBD方法轉(zhuǎn)換器執(zhí)行。該轉(zhuǎn)換器是一款操作簡(jiǎn)單的應(yīng)用程序，可執(zhí)行所有分析級(jí)到制備級(jí)的放大計(jì)算，包括上樣量、系統(tǒng)體積、流速、溶劑體積消耗量、質(zhì)譜引導(dǎo)的色譜分離方法的分流比計(jì)算，以及梯度聚焦UPLC方法到制備級(jí)方法的轉(zhuǎn)換等。您可以通過(guò)www.waters.com/prepcalculator 或沃特世純化軟件（如ChromScope?）訪(fǎng)問(wèn)該應(yīng)用程序。

圖26：沃特世制備型OBD方法轉(zhuǎn)換器，可通過(guò)www.waters.com/prepcalculator 上的Web Toolbox（網(wǎng)絡(luò)工具箱）訪(fǎng)問(wèn)。